采用泡沫陶瓷固定化酵母细胞，并对其应用于啤酒连续主发酵进行了实验研究，获取了优化的工艺条件。发酵温度16℃，稀释率0.044h－1。在此工艺条件下，实际测得浓度降低为7.09%，嫩啤酒双乙酰含量为0.144mg /L。对嫩啤酒主要理化指标的测定结果表明：采用固定化酵母细胞啤酒主发酵工艺不会对啤酒质量造成影响。

    　固定化技术应用于啤酒的工业化生产，主要是为了实现连续快速发酵的目的。

　　首先，固定化技术应用在后发酵阶段获得了成功，目前已应用于整个啤酒的发酵过程，包括主发酵阶段。固定化酵母细胞常采用的方法是在聚合物载体中进行包埋，将其应用于啤酒的主发酵却难以实现。由于载体结构及尺寸的原因，只有固定在载体表面的酵母与麦汁中的溶氧接触、繁殖旺盛，而包埋于载体内的酵母与氧的接触少，或因酒精在载体内的积累，使酵母繁殖受到抑制，因而酵母对α—氨基氮的同化率低，主发酵完毕的酒液存在着游离α—氨基氮和双乙酰含量过高的质量问题，不易解决。

    　泡沫陶瓷是多孔网络状陶瓷材料，其孔径比酵母细胞大得多，而且采用吸附固定化的方法，吸附于载体表面及多孔网络内部的酵母细胞与麦汁能够充分接触，比较适合应用于啤酒的主发酵。在已完成了固定化酵母细胞制备技术的基础上，对泡沫陶瓷固定化酵母细胞啤酒连续主发酵工艺进行实验研究，获取优化的工艺条件。

1材料与方法

    　1.1 实验材料

    　载体　泡沫陶瓷由景德镇陶瓷研究所提供；原料　添加酒花并经煮沸冷却的11°P麦汁，浙江钱江啤酒厂提供；啤酒酵母　生产用零代酵母，浙江钱江啤酒厂提供。

    　1.2 实验方法

    　1.2.1 泡沫陶瓷固定化酵母细胞生物催化剂的制备为优化泡沫陶瓷固定化酵母细胞生物催化剂的制备。14℃条件下于反应器中吸附酵母细胞20min，然后在相同温度条件下连续培养4h， 固定化酵母可达到的细胞密度为： 1.1 ×10⁸ 个/mL麦汁。

    　1.2.2 泡沫陶瓷固定化酵母细胞啤酒连续主发酵系统

　　泡沫陶瓷固定化酵母细胞啤酒连续主发酵系统，将麦汁贮存于贮罐中，通过计量泵将麦汁输入泡沫陶瓷固定化酵母细胞填充床反应器中，进行啤酒连续主发酵，同时发酵终了的嫩啤酒贮于贮罐中。反应器带有夹套，用酒精制冷，调节其流量可控制发酵温度。进出口处设取样口。反应器容积为84.8L，LD= 0.3m，L /D= 4ε（床孔隙率）＝54%。

    　本研究中稀释率的定义及控制：

    　D = F / （εVR ）= 1 /τ

    　其中，D 为稀释率， h^—1；ε为床孔隙率；VR 为反应器容积，L；F 为麦汁流量，L·h^—1；τ为平均停留时间，h。通过调节计量泵可改变麦汁流量，从而可调控稀释率。

    　1.2.3泡沫陶瓷固定化酵母细胞啤酒连续主发酵实验　

　　为使固定化连续发酵技术能应用于啤酒的整个发酵过程，在保证主发酵终了时酒液实际浓度较低的前提下，双乙酰含量也应尽可能的低，所以确定主发酵实验综合考察酒液浓度的降低及双乙酰含量这两个指标，影响因素主要是发酵温度和稀释率。通过预实验确定中心点（零水平），应用二次通用旋转中心组合实验设计的方法来安排实验。两因素（发酵温度和稀释率）上、下水平及r的取值依据是酵母细胞对温度的要求及预期的发酵时间。对实验结果进行回归分析及优化处理，获取泡沫陶瓷固定化酵母细胞啤酒连续主发酵优化的工艺条件。

    　1.2.4 嫩啤酒主要理化指标的测定　

　　对主发酵结束后的嫩啤酒进行酒精含量、原麦汁浓度、总酸含量和双乙酰文章来源华夏酒报含量等主要理化指标的测定，以考察采用泡沫陶瓷固定化酵母细胞啤酒连续主发酵工艺是否影响啤酒的质量。酒精含量：蒸馏法；原麦汁浓度： 比重瓶法；总酸含量：滴定法；双乙酰含量：蒸馏法。

2 结果与分析

    　2.1 泡沫陶瓷固定化酵母细胞啤酒连续主发酵工艺条件的优化通过计量泵将麦汁输入固定化酵母填充床反应器，按实验方案控制发酵温度（ x₁ ）及稀释率（ x₂），进行连续主发酵实验。

　　首先在反应器入口处取样测定原麦汁浓度，反应器起动后，需经一段时间方可达到拟稳态，此时于反应器出口处测得的实际浓度和双乙酰的含量基本保持不变。由进出口处麦汁浓度的测定值计算出浓度的降低，浓度的降低（%）和双乙酰的含量（mg /L）分别用y1和y2表示。二次通用旋转中心组合实验设计方案及实验结果如表1所示。

    　利用DPS统计分析软件, 对实验结果进行回归分析, 可得两个实验指标与两因素之间的回归关系方程：

     y¹₁ = 6.90401＋ 0.92749x₁－ 2.10231x₂ －0.46211x₂¹－0.01698x²₂ ＋ 0.01000x₁ x₂ （方程式1）
    y¹₂ = 0.15160＋0.01779x₁＋ 0.01006x₂＋0.04140x₂¹＋0.00539x²₂ ＋0.00175x₁ x₂ （方程式2）

    　对回归方程式1和方程式2分别进行显著性检验，方差分析的结果表明：回归（方程式1和 2）均在α＝0.001水平上高度显著，两方程中x22和x1 x2 项的回归系数均在0.1水平上不显著， 所以应从方程中剔除该不显著项，得简化后的回归方程分别为：

    　y ¹₁ = 6.90401+0.92749x₁ －0.10231x₂－ 0.46211x²₁ （方程式 3）
    　y¹₂ = 0.15160+0.01779x₁+ 0.01006x₂+ 0.04140x²₁ （方程式4）

　　要满足固定化酵母细胞啤酒连续后发酵的工艺要求，应使浓度的降低大于7.0%，或者十分接近这一数值；主发酵结束时双乙酰的含量不应超过0.190mg /L。

    　可采用模型模拟的方法， 对回归方程式 3和方程式4在约束条件y₁ > 7.0，y₂ < 0.190下进行非线性优化。利用DPS统计分析软件，在和的取值范围内，对回归方程式（ 3）和式（ 4）进行模拟运算， 当y₁ =7.0063， y₂ = 0.1415 时，x₁ = 0 （16.0℃），x₂ = —1（0.044h^{- 1}）。在发酵温度16℃，稀释率0.044h^－1条件下，进行验证实验，测得浓度降低为7.09% ， 嫩啤酒双乙酰含量为0.144mg /L，实测值非常接近预期值。

    　2. 2 嫩啤酒主要理化指标的测定结果在优化的工艺条件下，进行泡沫陶瓷固定化酵母细胞啤酒连续主发酵，测定嫩啤酒的主要理化指标，并与采用传统工艺生产的嫩啤酒进行比较，结果如表2所示。传统工艺主发酵时间约为6d左右；采用泡沫陶瓷固定化酵母工艺主发酵时间很短，在上述优化的工艺条件下约为23h，极大缩短了发酵时间。

    　由嫩啤酒主要理化指标的测定结果可知，采用固定化酵母工艺，嫩啤酒的几项主要理化指标均与传统工艺比较接近，可以认为该工艺不会对啤酒质量造成影响。

3 讨论

    　主发酵时间为20h—26h，嫩啤酒双乙酰含量为0.3mg /L—0.5mg /L；上述实验结果的发酵时间为23h，嫩啤酒双乙酰含量为0.144mg /L。发酵时间与文献接近，但主发酵结束后嫩啤酒双乙酰含量要低很多，将有利于后发酵双乙酰的还原。

表1  二次通用旋转中心组合实验设计方案及结果

表2  嫩啤酒的主要理化指标