用微生物生产多粮浓香型白酒风味物质的研究尹昌树1，刘波1，张义正3，陈大理1，岳明生
    　以五粮液为代表的宜宾多粮浓香型白酒的生产离不开当地独特的自然环境。作为中国酒都，地处三江交汇处，宜宾特殊的气候环境孕育出了独特的酿酒微生物生态区系。一般认为，在浓香型白酒生产过程中，霉菌主要起糖化作用，酵母发酵产生酒精，细菌主要参与形成白酒复杂的风味和香气。四川省申联生物科技有限责任公司的科技人员利用纯培养的方法对多粮浓香型白酒生产环节中优势细菌开展研究，筛选出5株对宜宾多粮浓香型白酒酒体独特风格起主要作用的微生物菌株，并运用现代发酵技术及超临界萃取技术生产出多粮浓香型白酒风味物质。

    　1材料与方法
    　1.1材料
    　1.1.1菌种

    　从四川某浓香型酒厂酿酒车间的窖泥、酒糟、曲药、黄水中筛选。分别编号SL0015、SL0061、SL0098、SL0106、SL0158，4℃保藏备用。

    　1.1.2试剂
    　高纯二氧化碳，食品级99.99%。
    　1.1.3主要仪器和设备

    　Agilent CC 6890－5975rnfKs，美国安捷伦科技有限公司；AgilentC－C6890－FID，美国安捷伦科技有限公司；DD－6低速大容量离心机，济南福的机械有限公司；超临界萃取设备，HA120－50－01A，江苏南通华安超临界萃取有限公司；UF－20型实验型超滤装置，华泰净化技术工程有限公司；10L发酵罐，50L发酵罐，江苏镇江东方生物工程设备技术有限责任公司。

    　1.1.4培养基
    　1.1.4.1种子液培养基
    　牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖胰胨培养基。
    　1.1.4.2发酵培养基（g/L）

    　1.2 方法
    　1.2.1种子液培养
    　将菌种接种于种子培养液中，其中SL0015、SL0098、SL0106培养温度42℃，150rpm，培养28小时。SL0061、SL0158培养温度35℃，静止培养，培养3天。

    　1.2.2发酵培养
    　1.2.2.1各菌种单独培养。
    　1.2.2.2各菌种混合培养。
    　1.2.3感官评定

    　品评人员由国家评酒委员和从事白酒研究工作并经过半年闻香训练的人员组成。每个样品由4名品评人员分3次进行品评。在20℃的品评环境下，评价发酵液的浓香，按很弱、弱、一般、强、很强5个等级分类。

    　1.2.4发酵液中特征性风味化合物的分析

    　1.2.4.1GC—MS分析
    　样品通过DB—Wax毛细管柱进行分离，程序升温条件：初温40℃，恒温5min，然后以8℃/min的速率升至230℃，保持30min。进样量：1μL，不分流。载气：He；流速：2 mL/min。分离后的样品用Agilent5975MSD鉴定。质谱条件El：电离源；电子能量：70eV；离子源温度：230℃；扫描范围：30amu—550amu。

    　1.2.4.2 物质定性分析
    　将未知物质谱图与NIST 08a.L Database（Agilent Technologies Inc．）中标准谱图进行比对定性。

    　1.2.5超临界CO₂ 萃取

    　1.2.5.1预处理
    　发酵液→粗过滤→超滤→清液

    　1.2.5.2　
    　取1L发酵清液投入萃取釜，将萃取釜温度升至设定值后开启CO₂ 泵，萃取压力升至设定值后进行流动萃取，从解析釜出料口得萃取物，将所得液体进行GC－MS分析。

    　2结果与讨论

    　2.1单独培养与混合培养比较

    　发酵结束后，取样进行感官评价。通过菌种单独培养与混合培养所产香气的比较可以看出，筛选出的菌株进行单独培养，所产香气均不强，而混合培养，则香气浓。这与菌种间的协同作用有关，因为某种菌种的产物可能是另一种菌种的前体物质，或是两种菌种的产物在酶的作用下进行一些反应，如酯化反应等。

    　2.2混合培养条件的研究

    　2.2.1培养基的选择

    　利用上述培养基分别发酵，发酵结束后，取样进行感官评价，通过不同培养基生长情况及产香情况的比较可知，培养基A营养丰富，菌种生长快，但产香弱；培养基C产香强，但生长太慢；而培养基B取了A、C的优点，菌种生长较快，产香强。选培养基B作为以下试验的培养基。

    　2.2.2培养温度的选择
    　我们以下列控温方式做试验：①35℃，②先35℃后42℃，③42℃，发酵结束后，取样进行感官评价。

    　通过不同控温方式对产香的影响比较可知，控温方式以先35℃后42℃为最佳。

    　2.3超临界CO₂ 萃取条件的研究

    　2.3.1萃取温度的确定

    　超临界CO₂ 的临界点为7.52MPa、31.1℃，因此试验的温度、压力都不能低于这个数值。另外， 由于超临界CO₂所萃取的物质一般都为热敏性物质，萃取温度不能太高，所以对萃取温度的调节非常重要。通过四组单因素试验确定萃取温度，试验结果见表1。

表1  萃取温度选取试验

    　通过以上试验可以看出，3号样虽然萃取率略低于2号样，但其风味更佳，所以萃取温度选为45℃。

    　2.3.2 萃取压力的确定
    　选取萃取压力的试验结果见表2。

表2  萃取压力选取试验

    　从表2可以看出，13号样品萃取率高且风味好，因此萃取压力确定为15MPa。

    　2.3.3 CO₂流量的确定

    　选取CO₂流量的试验结果见表3。

表3   CO₂流量的选取试验

    　从表3可以看出，不同的CO₂流量对所得萃取物的品质无影响，但在相同的萃取时间下，流速越大，取得率越高。因此，确认CO₂流量为10L/h。

    　2.3.4&n文章来源华夏酒报bsp;分离温度的确定

    　选取分离温度的试验结果见表4。

表4   分离温度的选取试验

    　从表4可以看出，分离温度越低，萃取率越高，但品质不好，分离温度选取为50℃。

    　2.3.5分离压力的确定

    　选取分离压力的试验结果见表5。

表5   分离压力的选取试验

    　从表5可以看出，分离压力越大，萃取率越低，但品质更好，综合考虑确定分离压力为7MPa。

    　2.3.6 解析釜压力、温度的确定

    　为确保在解析釜中萃取物质的完全解析，解析压力越低越好，但考虑到CO2能重复利用， 因此， 解析压力与CO2储罐中压力相同, 即在4.5—6.0MPa之间，解析釜温度设定为55℃。

    　2.3.7 萃取时间的确定

    　萃取时间在4h 后， 产品得率很小， 因此将萃取时间定为4h。

    　3结论

    　3.1以筛选的微生物菌株进行多粮浓香型白酒的呈香呈味物质的生产，并确定了多菌种混合发酵的培养模式。

    　3.2确定了发酵液进行超临界CO₂ 萃取的最佳工艺：萃取压力15 MPa,萃取温度45℃，CO流量为10L/h，柱分离压力为7MPa, 分离温度为50℃，解析釜分离压力为4.5—6.0 MPa, 温度为55℃，萃取时间为4h。

    　3.3所得萃取液经专家鉴定，具有典型的多粮浓香型白酒的风味：白酒固态发酵感强，粮香突出，糟香优雅，窖香柔和。