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解析绍兴黄酒麦曲中真菌的分离鉴定
2015-12-21 10:58:05   来源:   评论:0

     麦曲在黄酒酿造中起着重要的作用。分析微生物在麦曲中的区系分布和其中微生物菌群的系统发育,对于理顺麦曲中的微生物与产地环境的相互关系、建立麦曲微生物生态数据库和麦曲品质的分子评价指标,具有重要的指导意义。

不同培养基进行真菌平板分离的结果

     为了最大限度地分离出麦曲中的真菌,采用了三种培养基,其中PDA和CPK培养基是用来分离真菌的常用培养基,此外还使用了麦曲浸提液培养基(WQE),因为它的营养成份近似于微生物最原始的生存环境。对于三种培养基进行平板菌落计数,PDA和WQE培养基上的菌落数在48小时后达到最大,菌落数分别达到4.7×104cfu/g干曲和8.4×104cfu/g干曲。而在CPK培养基上,由于本身是合成培养基,营养不够丰富,所以24小时后开始慢慢形成菌落,56小时后达到最大值,仅为1.4×104 cfu/g干曲。

不同培养基的麦曲真菌分布

     根据菌落大小、形态和颜色等表型特征进行初步区分,共得到24株纯种菌株。各个纯株在3种分离培养基上的分布情况见表1。从PDA,CPK和WQE三种培养基上分离得到的纯种真菌分别为8种、18种和11种。PDA是营养丰富的培养基,但分离出来的真菌数目最少。而近似于微生物最原始生存环境的WQE培养基分离得到的真菌种类,要比预期的少。在合成培养基CPK上分离获得的真菌种类最多,暗示在低营养长时间的培养条件下,能够较多地回收得到麦曲样品中的真菌。

     将10—5稀释度以上检测到的真菌认为是麦曲样品中的优势菌。从表中可以看出,不同的培养基分离出来的优势菌是不一样的,且每一种培养基都能检测到其它培养基所不能检测到的优势菌株,所以必须联合使用多种分离培养基,才能准确解析麦曲中的真菌多样性。另外,在分离培养基中有必要加入去氧胆酸钠来抑制菌丝的蔓延。

纯种真菌的鉴定

     对分离获得的24株真菌纯株进行形态初步鉴定和基于ITS序列的分子鉴定,具体测序结果见表1。


     综合平板分离和测序的结果可以看出,通过大规模的系统分离培养方法确定麦曲中的优势真菌为:伞枝犁头霉(Absidia corymbifera—like),米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus.niger)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、季氏毕赤氏酵母(Pichia guilliermondii)和异常毕赤酵母(Pichia anomala)。
    本研究分离鉴定出的焦曲霉(Aspergillus ustus)、土曲霉(Aspergillus terreus—like)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、桔青霉(Penicillium citrimum)、季氏毕赤酵母、异常毕赤酵母,小孢根霉,多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)、球毛壳霉(Chaetomium globasum)、阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)和Phaeosphaeria fuckelii等菌株在以前的研究结果中均未出现。所用的麦曲是人工脚踏成型,此前公司采用培养法对机制麦曲中的真菌进行过研究,机制麦曲中的优势真菌为伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、米根霉(Rhizopus oryzae)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。除了米根霉以外,其余优势真菌与本文的研究结果一致。

     人工脚踏成型麦曲中的真菌种类比机械压制成型麦曲丰富,其原因是人工踩制曲坯能起到提浆作用,赋予曲坯表面较丰富的营养和较好的保温功能,因而比机械压制成型的曲坯更适合微生物的生长繁殖。

     对分离获得的真菌纯株序列进行系统发育分析发现,所分离得到的纯种菌株大致分为11个属,分别是曲霉属(Aspergillus)、犁头霉属(Absidia)、根霉属(Rhizopusmucor)、毛霉属(Rhizopus)、青霉属(Penicillium)、散囊菌属(Eurotium)、枝孢属(Cladosporium)、毕赤酵母属(Pichia)、球毛壳属(Chaetomium)、念珠属(Candida)和伊萨酵母属(Issatchenkia),反映出绍兴黄酒成品麦曲中真菌的资源非常丰富。从属的分类水平来看,在脚踏曲中出现的属除了散囊菌属(Eurotium)、毕赤酵母属(Pichia)和球毛壳属(Chaetomium)外,其它的属在机制曲中均有出现。   
 

    本文所得到的序列用菌名加代号表示,来自于GenBank数据库的序列用菌名加登录号表示。比例尺代表5%的核酸序列差异性。

核糖体内转录基因间隔区
分析麦曲中真菌群落构成

     免培养法提取麦曲中微生物总DNA显示了9条带,其中条带8、条带5、条带4 和条带3,亮度最高。免培养法指纹图谱中的条带,经过回收后的测序结果见表2。


  采用分子生物学技术和传统培养富集法分析麦曲中真菌的RISA指纹图谱有明显的差异。免培养法指纹图谱中检测到的9条带,其中5条带所代表的微生物(Absidia corymbifera, Rhizomucor pusillus、 Aspergillus oryzae、 Emericella nidulans、Clavispora lusitaniae)通过培养法分离得到。对应于条带3,条带7和条带8的真菌热带假丝酵母(Candida tropicalis)、 米根霉(Rhizopus oryzae)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),通过分离培养法没有检出。

     造成上述现象的原因可能是:           

  第一、所用培养基的选择性;第二、麦曲中其他真菌的抑制;第三、经过制曲过程中的高温选择后。这3种真菌在最终的成品麦曲中没有活细胞,但是用不辨别死活细胞的免培养法可以检测出来。另外,通过不同的分离培养基检测出的19株真菌通过免培养法未能检测到,可能是由免培养技术本身引起的。

  据悉,一方面,在样品中的含量低于1%的微生物通过免培养法无法检测到,而这些含量比较低的微生物通过培养法可以检测到;另一方面,有些微生物在样品中的含量很少,但通过培养基富集后,其数量增加,以致于通过RISA技术被检测出来,从而在液态富集的指纹图谱中出现。

  因此,为了更加准确的认识麦曲中的真菌群落结构,应该联合使用培养法和分子生物学技术。通过培养法未能得到的序列;由于技术原因,条带2未能检测到。
 

    综合分析免培养法和培养法检测黄酒麦曲中真菌的结果,初步认为麦曲中的主要真菌为:伞枝犁头霉、米曲霉、烟曲霉、黑曲霉、小孢根霉、微小根毛霉、季氏毕赤氏酵母、异常毕赤酵母、米根霉、酿酒酵母、热带假丝酵母文章来源华夏酒报、构巢裸孢壳及葡萄牙念珠菌。

纯种真菌的显微图片


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编辑:苗倩

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