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PCR技术检测啤酒中腐败菌的研究进展
2007-03-14 08:02:03   来源: 《华夏酒报》   作者:山西农业大学食品学院/张小军天津大学农业   评论:0

     1 传统检测方法的原理和缺点1.1 传统检测方法的原理
     目前,啤酒腐败菌的检测,特别是啤酒生产企业,大多数在人工制作培养基上培养。其原理是根据不同腐败菌生长所需的营养成分、最适温度、最适pH,在其适宜的温度下培养,然后根据不同菌落、细胞特征及一些生理生化特征的鉴定来确定腐败菌的类型。理论上只要在啤酒中有一个腐败菌的细胞,就能在适宜的温度、培养基上大量生长繁殖。然后通过菌落形态、细胞形态、革兰氏染色、过氧化氢酶阳性以及一系列生理生化实验来鉴定这些腐败菌。
     1.2 传统检测方法的缺点
     尽管目前许多企业仍然在用传统方法检测啤酒中的腐败菌,但传统检测方法有以下几方面的不足。
     1.2.1 检测所需的时间长:一般的腐败菌检测至少需要2~5d,甚至7d以上。检验结果出来时往往产品已经进入市场,具有严重的滞后性。
     1.2.2 操作繁琐,自动化程度不高:传统的检测方法往往需要花费大量的人力。适合不同腐败菌生长的培养基以及不同腐败菌适宜生长的pH、温度等都需要花费一定的人力和时间,观察菌落特征、细胞特征、革兰氏染色以及生理生化鉴定等步骤较繁琐。而且,研究表明,没有一种培养基适合所有的啤酒腐败菌生长。
     1.2.3 检测结果不够准确:啤酒腐败菌包括一些乳酸菌、醋酸菌和野生酵母等,特别是一部分乳酸菌具有酒花抗性,它们是最重要的啤酒腐败菌。几乎所有的乳酸菌都能在啤酒中生长,但只有一部分乳酸菌才能使啤酒腐败变质。所以,用传统的检测方法不能真正准确地检测出啤酒的腐败菌。
     2 PCR技术检测啤酒腐败菌的原理和特点
     PCR技术是由Kleppe等人在1971年首先提出的。它是通过对人工耗时长或难以培养的微生物的DNA或RNA片断的扩增来对啤酒中腐败菌进行检测的。首先通过高温变性、低温退火、适温延伸完成对目的基因的扩增阶段,然后将PCR产物通过琼脂凝胶电泳分析。整个过程可在1h内完成。而且从理论上讲,只要啤酒中含有一分子的腐败菌的DNA或RNA片段,即可在短时间内通过PCR技术大量扩增并检测到。所以,PCR检测技术在啤酒腐败菌的检测中显示出其他方法无法比拟的优点———快速、便捷、准确。
     根据PCR扩增使用的引物不同。用PCR技术检测啤酒中腐败菌的方法大体可归为3种类型:使用特异性引物的PCR检测方法;使用任意引物的PCR检测方法;使用嵌套式引物的PCR检测方法。
     3 用特异性引物的PCR检测方法
     3.1 根据抗酒花基因horA设计特异性引物
     尽管啤酒中的许多成分对微生物造成很大的抑制作用,但一些微生物(主要是一些乳酸菌)却仍然能在啤酒中生长繁殖,并使啤酒产生浑浊、沉淀、异味和双乙酰等腐败现象。有趣的是,这些对革兰氏阳性菌有抑制作用的酒花物质(主要是异-α-酸)对这些乳酸菌却无济于事。因此,许多学者都致力于抗酒花机理和基因的研究。日本学者从抗酒花菌株短乳杆菌ABBC45的质粒上鉴定得到抗酒花基因horA,后经研究发现,能引起啤酒腐败的乳杆菌均含有似horA的基因。1997年,Manabu Sami等还发现啤酒腐败菌中这些含有抗酒花基因的质粒拷贝数与酒花抗性大小的增减性是一致的,这说明horA基因与酒花抗性有关。东京大学、加利福尼亚大学的研究者通过设计特异性引物对一系列乳杆菌的horA基因扩增进行检测,已成功地从啤酒中对乳杆菌、干酪乳杆菌、胚芽乳杆菌进行了检测,且准确性高,整个horA-PCR检测过程大约需6h,比传统的平板培养方法要快得多。
     3.2 根据其他一些与酒花抗性有关的基因设计引物
     K.suzuki等对啤酒腐败菌的研究发现,在对完全丧失腐败能力的短乳杆菌ABBC45CC(是经过短乳杆菌ABBC45C次级培养获得的)分析发现,质粒PRH45Ⅱ在短乳杆菌ABBC45CC中丢失,随后通过对质粒PRH45Ⅱ上的不同区域的片段进行切除,结果发现啤酒腐败菌缺少ORF5的比例相当高,所以通过对OFRF5的序列设计引物来进行PCR技术检测啤酒腐败菌也取得了一定效果。最近,Koji Suzuki和T.Fujii通过大量的实验研究表明,一些含有horA基因的乳杆菌也并不具有腐败能力,而且他们发现丢失horA基因的L.brevisABBC45-L.brevisAB-BC45C仍然有一定的腐败能力。因此,他们认为抗酒花机制是由多重基因控制决定的。Koji Suzuki对51株啤酒腐败菌研究,还发现有两个基因horB和horC与酒花抗性有关。研究发现,通过对horB/horC基因的扩增能检出其中的49株腐败菌,且无假阳性的检出。因此,他们认为PCR技术检测通过结合horA、horB/horC基因能大大提高啤酒中腐败菌的检测,同时可避免由horA引起的假阳性现象。
     3.3 根据分类鉴定法设计特异性引物
     啤酒中腐败菌主要是乳酸菌,其中主要包括短乳杆菌、有害片球菌、林氏乳杆菌等,短乳杆菌、有害片球菌是啤酒中很有名的腐败菌,而林氏乳杆菌到目前为止发现的所有菌株都是啤酒腐败菌。因此,有人用分类鉴定的核糖体RNA上的基因序列来检测啤酒中的这些腐败菌。加拿大Labatt公司的研究人员在啤酒腐败菌的乳酸菌的检测中使用5S和16SRNA基因进行PCR扩增,用于菌种的特性鉴定。目前已成功地对乳杆菌、片球菌、明膜串珠菌属中的菌株作出鉴定。日本为了提高PCR分析的灵敏度和特异性,根据16SrRNA和23SrRNA之间的间隔区的特异性序列来设计引物,用于啤酒腐败菌的PCR检测。这种方法比较快捷、方便,但有时难以将种内一些腐败菌和非腐败菌区分开。
     3.4 利用任意引物的PCR检测方法(RAPD-PCR)RAPD-PCR是使用较短的寡核苷酸引物扩增一群长度不等的DNA片段混合物,这些产物经琼脂糖凝胶电泳呈现出的带型,反映了用于扩增模板的DNA分子的总体结构特征,所以能够测出2个生物体(包括同一物种的不同个体)基因之间的差异。亲缘关系越近的种,PCR扩增带型就越相似,反之差异悬殊。
     使用RAPD-PCR技术,所需DNA提取物少,在10h内能检测出啤酒污染的结果,每一种引物能产生惟一的特异性指纹图谱,将其对照便得到鉴定结果,加拿大LABATT公司的研究人员运用此技术鉴别啤酒腐败细菌的种和亚种。
     3.5 利用嵌套式引物的PCR检测方法(Nest-PCR)Nest-PCR是利用第一轮PCR产物作为第二轮PCR扩增的起始原料,除使用第一轮的一对特异性引物外,还加一对结合位点处在前2个引物之间的新引物。
     啤酒中含有大量的酵母,因此用PCR技术检测啤酒中腐败菌时,酵母会对其形成一定的干扰。使用普通的PCR检测腐败菌时,酵母细胞的存在如果大于3×104(上角)时,就会干扰细菌的鉴定。如果对样品进行稀释来降低酵母的干扰,同样也会降低检测水平。而使用Nest-PCR检测腐败菌时,由于第一轮反应之后增文章来源华夏酒报加了靶模板数量,使第二轮反应的效率明显提高;由于第一轮反应产物比第一轮反应的模板DNA小,所以在第二轮反应过程DNA变性时间缩短,也使得反应速度加快。
     加拿大Labatt公司的研究者通过实验确定和检测用于乳酸菌鉴定的Nest-PCR的引物,实验结果表明,当酵母和细菌细胞之比为1.6×104(上角)∶1时,凝胶电泳清晰可见。Nest-PCR技术使在发酵结束和酵母回收前24h内完成对污染菌的检测分析成为可能,从而确保了啤酒生产中微生物的控制。
     因此,Nest-PCR技术检测啤酒腐败菌能提高检测效率,特别是对含有高浓度酵母细胞的样品的检测。
     4 PCR技术检测啤酒腐败菌的发展趋向
     随着分子生物学、光学、免疫学、微生物学、计算机技术的快速发展,应用PCR技术检测啤酒腐败菌也越来越趋向于同其他技术紧密结合应用。
     4.1 取样
     在取样阶段,研究者发现,啤酒中高浓度物质的存在对PCR的灵敏度也有一定的影响。当利用膜过滤啤酒富集乳酸菌用于检测时,实际灵敏度也随过滤啤酒体积增加而降低。而不同啤酒的抑制因子也有所不同。日本学者通过在特异性引物的PCR实验(L.lindner)中发现使用水样检出限(63cfu)比啤酒的检出限(9cfu)明显低,这说明啤酒中存在一些抑制因子。
     Di Michele和Le Wis进行了大量的实验发现,用纤维素酯膜过滤,在丙酮酸中溶解,积累于膜上的PCR抑制因子并没有除去;采用聚碳酸酯膜,用十六烷基三甲基溴化铵溶液提取,仅适用一些含菌量高的样品;用聚碳酸酯膜过滤,将膜溶于四氯化碳-异戊醇,再转入Eppendorf管中加水、离心沉淀、取上清液、再加水离心沉淀处理后灵敏度大大提高。日本的学者也用了类似的方法提高了检测限度。
     4.2 引物使用
     在使用引物方面,目前尽管研究者已经发现从L.brevisABBC45的大小为15.1kb的质粒pRH45上分离得到的horA基因与细菌的抗酒花作用有很大的关系。但也有一些实验表明,丢失含有horA基因的质粒pRH45的L.brevisABBC45C 仍然有一定的抗酒花性,这说明抗酒花还可能存在其他基因控制。特别是在对抗酒花菌株质粒ORF上的一些核苷酸序列的研究表明(ORF5研究比较深入),其也与抗酒性有很大关系。因此,PCR技术检测啤酒中腐败菌的设计引物要从单一的特异性引物向多种特异性引物发展。不久的将来啤酒腐败菌的定量检测也会实现。

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编辑:张怡

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